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MercedesE. Gonzalez,九游娱乐网站 MD, Julie V. Schaffer, MD, Seth J. Orlow, MD, PhD, Zhan Gao, MD,Huilin Li, PhD, Alexander V. Alekseyenko, PhD, and Martin J. Blaser, MD

　　背景：特应性皮炎（AD）患者易出现皮肤感染，而金黄色葡萄球菌等微生物可能有致病性。漂白浴可能可以通过减轻皮肤微生物负担改善AD病情。

目的：我们试图描述AD患儿皮肤损害区、非皮损区和对照组的微生物学特征，并比较局部单独外用糖皮质激素（TCS）和TCS联合稀释漂白浴后的变化。

方法：本试验为随机安慰剂单盲对照试验，共纳入21名AD患儿和14名健康儿童，测定TCS或TCS联合漂白浴治疗基线和4周后皮损区和非皮损区的情况。提取微生物DNA，进行优势菌属的定量聚合酶链式反应（PCR）和16S rRNA的测序。

结果：最严重的AD皮损区细菌总数和包括金黄色葡萄球菌在内的葡萄球菌属的基线密度显著高于非皮损区（p=0.001）和对照组（p＜0.001）。AD皮损区和非皮损区的细菌群系有显著差异（p=0.04），与对照组相比也同样如此（p＜0.001）。TCS联合漂白浴和单独TCS治疗后，皮损区的细菌组成正常化（p＜0.0001），变得类似非皮损区，微生物多样性恢复到对照组水平。

局限性：4周的治疗时间和/或每周两次的洗浴可能并不足以对皮肤微生物群系产生额外影响。更详细的测序结果可能显示漂白浴治疗造成的细菌分类特征的差异。

结论：TCS乳膏治疗足以令AD损害的皮肤菌群正常化；皮损区的细菌群系在治疗后与非皮损区的类似，但仍与对照组不同。（J Am Acad Dermatol2016;75:481-93.）

关键词：特应性皮炎；漂白浴；皮肤微生物群系；定量聚合酶链式反应；16S测序；金黄色葡萄球菌；局部外用糖皮质激素。

　　JAAD内容提要

特应性皮炎（AD）的爆发与金黄色葡萄球菌密度的升高有关。

AD患儿非皮损区的微生物群系异常；局部外用糖皮质激素能使皮损区和非皮损区的微生物群系正常化。

应用丙酸氟替卡松乳膏进行标准的局部外用糖皮质激素治疗时，每周两次的漂白浴辅助治疗对于AD患者的临床改善和皮肤微生物群系的正常化不是九游官方网址必须的。

AD是九游官方入口一种慢性炎症性皮肤病，以特定分布的瘙痒性红斑损害为特征，常见于婴儿和儿童1。AD患儿的发病往往与特定细菌、真菌和病毒的皮肤感染有关。金黄色葡萄球菌普遍存在于AD皮肤，且培养结果示AD临床表现的严重程度与金黄色葡萄球菌的密度直接相关2。金黄色葡萄球菌是否与AD的病理生理相关，或仅反映异常的环境，尚无定论。分子技术使得皮肤病的菌群变化及其和临床特征间关系的描述更全面3,4。

本研究比较局部外用糖皮质激素（TCS）和TCS联合稀释漂白浴对AD的治疗效果。我们使用高通量DNA测序和定量聚合酶链反应（qPCR）对AD患儿和正常对照组进行皮肤菌群分析。比较皮损区、非皮损区和对照组在两种方法治疗前后的差异，使得对AD的微生物特征和伴随疾病活动度的变化描述更全面。我们的研究结果表明，即使在没有漂白浴辅助治疗的情况下，TCS对AD临床有效的同时也能使皮肤菌群正常化。

JAAD方法

患者和研究设计

将CharlesC. Harris皮肤和癌症单元、纽约大学（NYU）皮肤病协会（两者均位于纽约大学医学中心，NYULMC）和Bellevue医疗中心小儿皮肤病诊所就诊的3个月到5岁的中重度AD（基于Eichenfield等报道的改良Hanifin和Rajka标准）患儿纳入研究组5。对照组来自儿童诊所附近年龄相当且未患皮肤病的儿童。本研究经NYULMC机构审查委员会批准。

排除标准

排除伴其它慢性炎症性皮肤病、正在或两周内曾系统性使用或局部外用抗生素、糖皮质激素或钙调磷酸酶抑制剂以及显性皮肤感染的患儿。研究设计见图16。

随机化

治疗的随机化分配由两名独立的非临床工作人员完成。其中一名工作人员制作12个含“漂白剂”一词和12个含“水”一字的外观相同的密封信封，然后打乱信封并编号。另一名工作人员按编号顺序打开信封并按信封内的要求将漂白剂或水装入纯白色的瓶子中，然后给瓶子贴上相应的标签。

采样

所有AD患儿的4个拭子取材部位如下：1个取自损害最严重（即局部湿疹面积及严重度指数[EASI]评分最高）的部位，1个取自非皮损区，另两个取自典型皮损区。对照组患者的拭子取自皮损好发的部位。在可能的情况下，AD患儿非皮损区的取材应在皮损区的对称部位；若皮损对称，则在临近的未受损的部位取材。如文献所述，使用经0.9%生理盐水和0.1%吐温-20（Fisher Scientific，沃尔萨姆市，马萨诸塞州）湿润的无菌棉签，以适当压力擦拭特定部位皮肤40s以获取标本7。离心液应用PowerSoil kit（MoBio，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）按说明提取DNA。

定量聚合酶链式反应

按文献所述使用特定的引物和探针对金黄色葡萄球菌、其它葡萄球菌种、棒状杆菌属、丙酸杆菌属、链球菌属和常见细菌进行荧光探针qPCR测定8。以金黄色葡萄球菌特定的nuc基因为靶基因扩增该菌DNA。

高通量DNA测序

按文献所述，每个样本应用细菌通用引物515F/806R扩增16S rRNA的V4区三次9,10。

统计分析

对重复测量分析结果进行方差分析和事后比较检验，以比较不同皮肤部位、不同潮湿度和不同时间点皮脂腺的细菌密度。对称取样是为了便于说明同一患儿不同样本间的相关性。采用配对t检验比较不同方案治疗后细菌密度的差异，Spearman相关分析比较细菌密度和EASI间的关系，错误发现率用以控制多重比较，p＜0.05被认为有显著差异。测序数据的统计分析见补充方法。

JAAD结果

患者

纳入的21名患儿和对照组（未列出数据）间以及完成试验的18名患儿和对照组（附表I）间的性别、年龄和种族无明显差异，随机分入两个治疗组的患儿临床严重程度评分也同样如此。3名AD患儿（两名在安慰剂组，1名在漂白浴组）因搬迁或未再复诊而未接受随访评估，但他们的家长在联系时均表示他们的病情有所改善。在完成试验的患儿中，TCS单独治疗组患儿的平均年龄低于TCS联合漂白浴组和对照组（附表I）。正如预期，TCS联合漂白浴组的AD患儿有AD家族史的几率显著高于对照组（p=0.002），但经多重比较调整后，TCS单独治疗组与对照组间几率的差异并不明显。AD组和对照组间阴道分娩的比例、洗浴频率、末次洗浴的平均时间及局部外用乳膏的应用均无明显差异。

临床结果

18例完成试验的AD患儿临床评分均有显著改善；两个治疗组的患儿疗后IGA、整体EASI和局部EASI评分均有显著改善（附图1），但组间无明显差异。我们的队列中仅有两名患者属于学龄儿童（大于48个月）。我们应用多元线性回归模型分析EASI变化与年龄、治疗对照组、分娩方式和皮损部位的关系，发现年龄系数并不显著（p＞0.05）。因此，我们得出患儿年龄与疗效无关的结论。

细菌基线密度

我们在21名AD患儿身上取得63个皮损区和21个非皮损区的标本。正如预期，qPCR证实皮损区的细菌基线总数高于非皮损区和对照组，但后两者间无明显差异。葡萄球菌属的趋势也同样如此（图2）。然而对照组链球菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属的基线密度与皮损区和非皮损区均无明显差异。在损害最严重的部位，棒状杆菌属和丙酸杆菌属的密度显著低于对照组（数据未列出）。

正如预期，皮肤的总细菌密度和优势菌种与微环境（潮湿，干燥、皮脂腺等因素）有关（附图2）。众所周知，干燥皮肤的生物多样性最大，干燥皮损的细菌基线总数显著高于对照组11；皮脂腺部位的生物多样性最少，皮脂腺皮损的金黄色葡萄球菌基线密度显著高于对照组，尽管两者的葡萄球菌属并无明显差异。对照组干燥部位的棒状杆菌显著多于AD皮损区（附图2）。对照组和AD患儿非皮损区干燥皮肤和皮脂腺部位的细菌密度类似。

EASI临床评分和细菌密度的相关性

皮损区总细菌数和金黄色葡萄球菌的平均密度分别与整体EASI评分呈中度相关（附图3，A和B）。未检测到金黄色葡萄球菌的患儿倾向于有更低的整体EASI评分。

治疗对细菌密度的影响

TCS联合漂白浴和TCS单独治疗对细菌密度的影响见图3。

微生物状况

共对256个样本进行分析，得到1,246,175个序列（平均每个样本4297个序列[四分位数间距2700-6163]）。为确保比较有效，我们检查了249个样本（超过1000个序列可用）。

α多样性

基线处所有皮损区微生物群系的平均Shannon多样性指数与整体EASI评分呈负相关（附图3，C）。两种治疗方案均导致整体EASI评分的下降和多样性评分的上升（附图3，D）。线性回归分析表明治疗组随访的EASI评分与Shannon和丰富度的多样性不相关（p＞0.05）；因此，在两种成功的治疗方案中，不存在疾病严重程度和微生物多样性间的相关性。

细菌群系的丰富度和Shannon多样性指数在两种方案治疗后均显著升高，见图4。每个皮肤微环境均显示出类似的趋势（附图4）。

群系结构

调整分娩方式（经阴道或剖宫产）因素后应用UniFrac分析评估群系结构（β多样性），见图5。

微生物构成的分类丰度和变化

两个治疗组疗后皮损和非皮损区的微生物分类均正常化。

对照组皮肤、AD皮损和非皮损区治疗前后微生物主要门类和主要属的相对丰度分别见于图6和附图5。

绝大多数对照组样本中，13个主要菌属在所有序列中的基线占比不足50%（附图5），其中葡萄球菌属不足25%，显示菌属丰度低而多样性高。相反，皮损区葡萄球菌属的中位百分比为60%到70%（附图5，A和C），而非皮损区呈中间过渡状态（附图5，B和D）。在为期4周的随访后，对照组变化不大（附图5，J），但AD皮损和非皮损区的样本均趋于正常化（附图5，F和I）。对于非皮损区来说，与TCS单独治疗相比，漂白浴使得对葡萄球菌属的治疗抑制作用更大（附图5，G）。

曲线下面积占比至少1%的分类和菌属见图7。

　　JAAD讨论

基于16SrRNA保守区基因序列的高通量测序加深了皮肤病的微生物分析和我们对微生物角色的认识12-15。包括银屑病和AD在内的炎症性皮肤病的研究证实这些疾病与皮肤菌群的改变有关3,16-18。但微生物组成的改变是致病原因，还是炎症状态下表皮和固有免疫反应选择特定菌群的结果，仍有待确认。

以往基于培养的研究认为AD患儿皮损和非皮损区金黄色葡萄球菌的定植均在增加，本研究的种属特异qPCR结果证实了这个看法19-23。此外，还证实早前金黄色葡萄球菌的密度与疾病严重程度（以EASI评分为标准）相关的结论24,25。

Kong等的一项皮肤微生物群系研究通过16S rRNA基因的近全长测序，表明AD急性加重时，皮损区金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌定植大量增多，但链球菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属减少；疾病严重程度和皮肤细菌的多样性呈负相关3。该研究予患者多种治疗组合（TCS，漂白浴，局部外用和系统应用抗生素），后微生物的多样性恢复到基线状态，但事实上微生物的基线种类已经增多。此时的“基线”指的是疾病相对稳定时的状态，是疾病爆发数月后的某个时间点。由于此前已应用包括抗菌和抗炎的多种治疗方案，故何种治疗令微生物多样性正常化尚不明确。

本研究是一项前瞻性对照组临床试验，纳入的所有AD患儿在试验前两周均未接受任何治疗；所有参与者均予氟替卡松乳膏治疗，然后随机予漂白剂或安慰剂沐浴。细菌16S rRNA V4区允许属水平或更大测序深度（平均~4300）的测定，可以和许多其它应用V4区测序的研究进行比较26-28。本研究纳入3个月到5岁的患儿，与之前的研究相比AD的同质性更佳，且AD在该年龄段最高发。本研究的绝大多数患儿小于2岁，因此，据我们所知，本研究是第一个使用分子技术描述正常婴幼儿和AD患儿皮肤菌群的研究。

我们发现整体微生物多样性与疾病严重程度呈负相关，多样性低则与相对或绝对丰度高的金黄色葡萄球菌相关。非皮损区的多样性同样低于对照组，提示AD患儿有临床前皮肤菌群的改变。尽管以培养为基础的研究已显示非皮损区葡萄球菌定植率的增加，但尚未见应用qPCR和16Ss研究非损害区皮肤群系以及与对照组皮肤差异的分子鉴定研究29,30。

此外，我们发现AD皮损区和非皮损区的基线细菌群系构成均与对照组不同。在TCS免疫调节治疗伴或不伴漂白浴后，皮损区的细菌群系构成将类似非皮损区，但仍与对照组不同，表明AD伴固有的菌群异常。

一些研究表明，AD的非皮损区与正常皮肤有终末分化和免疫的差异31,32。AD的损害和非损害区皮肤均有经表皮水分丢失的增加、外用药吸收率的增加和抗菌肽的减少33,34。导致高PH和表皮水分减少的中间丝相关蛋白基因突变与AD严重程度、皮肤感染倾向和时间以及金黄色葡萄球菌定植的增多有关35-37。中间丝相关蛋白在AD非损害区的表达亦下降。皮肤菌群的构成同样与免疫缺陷患者对照组和缺陷小鼠的皮肤不同38,39。我们的观察表明除了皮肤免疫功能的改变以外，非皮损区还显示一种独特的微生物群系组成。

TCS伴或不伴漂白浴的治疗效果类似，均能显著改善临床，与此相关的还有皮损区微生物多样性的恢复和总细菌数、金黄色葡萄球菌以及其它葡萄球菌属的减少。最新的Cochrane系统评价认为，尽管抗葡萄球菌治疗能减少AD患者金黄色葡萄球菌的密度，但与抗炎治疗相比其临床获益并未增加，我们的研究结果与此一致40。一项关于AD患儿的随机研究显示，先予抗生素口服两周、后予每周两次的漂白浴联合鼻内莫匹罗星治疗3个月以抗皮肤感染的患者，其EASI评分的降低幅度显著大于安慰剂组；尽管金黄色葡萄球菌持续存在，但仍能观察到临床获益41。另一项关于儿童和成人AD患者的研究显示，每周两次漂白浴辅助治疗2个月后的EASI评分显著比单独应用TCS和护肤霜治疗的低；漂白浴能减少但不能完全消除金黄色葡萄球菌的定植42。我们为期4周的随访可能不足以观察漂白浴的疗效，且两个治疗组EASI评分的降低均十分显著，不便观察额外获益。次氯酸钠的抗炎和抗菌作用可能是漂白浴改善AD病情的原因43。

在两种治疗后，我们观察到以Shannon多样性指数衡量的整体皮肤微生物多样性恢复到对照组皮肤的水平，然而皮损区细菌群系组成只恢复到类似非皮损区的状态，仍不同于对照组皮肤。我们的研究结果表明TCS足以令皮损区的微生物群系正常化。我们不能排除丙酸氟替卡松乳膏赋形剂的作用。两种治疗后，金黄色葡萄球菌被棒状杆菌属、普雷沃菌属和不动杆菌属替代（图7）。棒状杆菌属是健康人皮肤上最丰富的菌属之一，可能与鼻孔金黄色葡萄球菌的数量呈负相关44。尽管不动杆菌属和普雷沃菌属并非主要的皮肤菌种，但它们可能是潮湿褶皱部位的正常菌群，且普雷沃菌属能见于阴道分娩的新生儿皮肤45-47。

尽管V4区的测序能让我们准确测定漂白剂的效果（图7和附图5），4周的随访和/或每周两次的洗浴可能不足以令漂白剂辅助治疗对皮肤微生物群系产生有意义的影响。此外，以往的研究显示漂白剂有临床效果，但我们的研究对象的平均年龄更低。在将来的研究中，进一步（V1-3区或全16S rRNA基因）测序会更详细地显示漂白浴治疗造成的微生物种属差异。

解读复杂的皮肤宿主-微生物和微生物-微生物间的相互作用以及它们在皮肤病固有免疫中的作用是一项艰巨的任务。某些共生菌，例如表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌，可抑制金黄色葡萄球菌，它们的重现意味着菌落平衡的重建48-51。近期研究表明，非致病菌能减轻AD相关的皮肤炎症52。相反，AD相关的金黄色葡萄球菌定植可能继发于疾病过程，而不是病因的代表，主要对皮肤屏障功能造成破坏53。TCS或他克莫司软膏的治疗均能观察到金黄色葡萄球菌水平的显著降低54,55。我们的研究再次证实炎症减轻和皮肤屏障功能的改善可能足以减少金黄色葡萄球菌的定植，并使AD菌群组成正常化3,56。近几十年来。皮肤科医师向AD患者推荐稀释的次氯酸钠（漂白剂）浴，却很少有研究严格评估这项措施的实用性。我们的研究并未发现在AD急性期联合漂白浴治疗比丙酸氟替卡松乳膏单独治疗获得更多的微生物学效应。需要进一步的研究明确稀释的漂白浴对AD长期维持治疗的价值。

方法补充说明

机构审查委员会

本研究经NYULMC机构审查委员会批准（#10-01622协议）；所有的家长均被详细告知研究协议，并为他们的孩子签署书面知情同意。

患者与研究设计

要求所有于CharlesC. Harris皮肤和癌症单元、NYU皮肤病协会（两者均位于NYULMC）和Bellevue医疗中心小儿皮肤病诊所就诊的所有符合纳入标准的中重度AD患儿加入本研究。所有参与者的家长在首次就诊时均填写一份详细的调查问卷。要求家长每天给孩子身上的湿疹区涂抹丙酸氟替卡松乳膏两次，此时仍能继续使用原有的保湿剂。此外还要求家长每周给孩子用既定的液体按给出的浓度洗浴两次。由于主要终点是确定细菌负荷和微生物组成在特定的微环境内随着时间推移的变化，在4周的随访后于与基线相同的部位取样。

EASI评分

1名研究者（M. E. G.）单独进行基线和治疗后的EASI评分。

漂白浴

给家长们提供一个如何制备漂白浴的指导讲义。他们按说明往半满的浴缸中加入1/4杯的家用漂白剂（次氯酸钠浓度6.15%），或均加倍（~40加仑），若使用的是婴儿浴盆，则每加仑的水中加入1/2茶匙的漂白剂。这些方法令次氯酸钠的浓度稀释到近0.005%，为临床上的标准浓度。随访中会询问是否按要求进行治疗。没有家长在试验期间给孩子系统（或局部）应用抗生素。

定量聚合酶链式反应

使用种属特异的16SrRNA细菌引物和探针对丙酸杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和棒状杆菌属进行荧光探针qPCR测定。标准为特定属16SrRNA基因和金黄色葡萄球菌的nuc基因聚合酶链反应（PCR）的克隆产物；qPCR按文献步骤操作8。加入3.5mol/L的MgCl2、0.4ng/μL的牛血清白蛋白、每种脱氧核苷三磷酸0.2mmol/L、每个引物10pmol、每个探针5pmol、Taq DNA聚合酶（Qiagen）0.625U和2μL提取的DNA样本，总反应体系为25μL。PCR条件为：94℃5min，94℃10s、54℃（引物：8F/Eub361R）或56℃（引物：Eub519R/U785R）45s和72℃60s循环45次。使用480 Lightcycler（Roche，印第安纳波利斯，印第安纳州）进行PCR两次。

高通量DNA测序

每个样本的细菌16SrRNA V4区应用细菌通用引物515F/806R扩增三次，该引物能广泛应用于细菌和古细菌16S rRNA的扩增。PCR反应体系包括11μL分子生物学级的水（Corning cellgro，Tewksbury，马塞诸萨州）、11μL 5Prime Hot Master Mix（5 Prime有限公司，盖瑟斯堡，马里兰州）、每个正向和反向引物1μL（终浓度为5μmol/L）和2μL的基因组DNA。反应：94℃3min使DNA变性；90℃45s、50℃60s和72℃90s，循环35次；72℃10min完成最后的扩展步骤。每个样本的扩增产物使用PicoGreen双链DNA试剂盒（Invitrogen）进行定量。汇集每个样本中的等量DNA进行PCR纯化（Qiagen，巴伦西亚，加利福尼亚州）。由Qubit高灵敏度双链DNA试剂（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）对这些纯化标本的DNA浓度进行定量测定，后在等浓度混合。在位于NYU基因组技术中心的Illumina MiSeq仪进行DNA测序。扩增产物的配对末端序列导入来自开源包EA-utils的软件FastqJoin，只留下重叠区配对完美的序列57。应用Quantitative Insights IntoMicrobial Ecology（QIIME）软件（版本1.7.0）对数据进行进一步处理，GreenGenes参考序列数据库（版本13.8）作为参考58-59。使用PyNAST模板校准程序和GreenGenes core-set校正模板对代表序列进行进一步校准60。我们应用FASTTREE软件重建一个近似的系统进化树61。

盲法

调查员、数据分析师和测序员并不知道治疗过程，直到试验结束、没有必要对数据分析使用盲法时。

测序数据的统计分析

使用R软件对测序数据集进行统计分析62。丰度表为每个样本在1000序列深度平均抽样20次以计算α多样性，用Mann-Whitney秩和检验比较差异。使用Pearson线性相关系数确定α多样性和EASI间的相关性。我们使用R软件中的ade4 package进行UniFrac distances的主坐标分析63。为避免负特征值，我们应用Cailliez法将欧几里得距离矩阵转换为相关矩阵，以进行主坐标分析64。主坐标分析观测使用R vegan包进行9999个排序的ADONIS测试以确定统计显著性65。操作分类单元相对丰度的单因素试验根据PESAME（Predictive Effect Size Analysisin Multivariate Ensembles）协议（A.V. Alekseyenko：未发表）进行，即应用多个测试错误发现率的方差控制的Kruskal-Wallis分析评估多层次差异的显著性66；应用Mann-Whitney检验评估配对差异，将U统计量转化为受试者工作特征曲线的曲线下面积估算预测效应大小。用正态近似法估算受试者工作特征曲线的曲线下面积的置信区间67。

　　JAAD参考文献

参考文献见下一篇，参考文献续

　　J Am Acad Dermatol 2016;75:481-93. © 2016 by theAmerican Academy of Dermatology, Inc.

（主题负责人：曹双林；审校：江勇；翻译：许凤妮，广西皮肤病防治研究所）

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